Лазерная сканирующая микроскопия. Конфокальная микроскопия

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Прижизненная отражательная конфокальная лазерная сканирующая микроскопия: история создания, принцип работы, возможности применения в дерматологии

Н.Н. ЛУКАШЕВА1 , С.Б. ТКАЧЕНКО1 , Н.Н. ПОТЕКАЕВ2 , Т.С. КУЗЬМИНА1 , Е.А. ВАСИЛЕВСКАЯ1

1 Лаборатория по изучению репаративных процессов в коже НИИ молекулярной медицины ММА им. И.М. Сеченова; 2 кафедра

кожных и венерических болезней ФППОВ ММА им. И.М. Сеченова

Lifetime-period reflecting confocal laser scan microscopy: the history of foundation, the principle of functioning, possibilities of using in dermatology

N.N. LUKASHEVA1 , S.B. TKACHENKO1 , N.N. POTEKAEV2 , T.S. KUZ’MINA1 , E.A. VASILEVSKAYA1

1 Laboratory by studying of reparative processes in the skin of Research Institute of molecular medicine of I.M. Sechenov Moscow medical academy; 2 FPPOP of I.M. Sechenov Moscow medical academy

Одной из тенденций современной медицины является применение неинвазивных органосохраняющих методов исследования. Благодаря научным разработкам и внедрению в практику инновационных технологий в последнее десятилетие появились новые неинвазивные высокоразрешающие методы исследования структуры кожи и других тканей. К ним относятся оптическая когерентная томография, высокочастотное ультразвуковое сканирование, ядерно-магнитный резонанс, конфокальная лазерная сканирующая микроскопия (КЛСМ). Последний метод занимает особое место среди визуализирующих технологий, так как позволяет получить изображение эпидермиса и поверхностной части дермы с разрешением, приближенным к традиционной световой микроскопии .

Основная концепция конфокальной микроскопии была разработана M. Minsky в середине 50-х годов прошлого столетия с целью исследования нейронной сети в нативном препарате ткани головного мозга без предварительного окрашивания . Это изобретение осталось без внимания в силу отсутствия на тот момент мощного источника света, необходимого для получения изображения, а также должного компьютерного оборудования для обработки полученной информации. Вслед за M. Minsky в 60-х годах M. Egger и M. Petran создали многолучевой конфокальный микроскоп с применением вращающегося диска для исследования неокрашенного препарата ткани головного мозга и клеток ганглиев . В 1973 г. благодаря работам M. Egger по дальнейшему совершенствованию конфокального лазерного сканирующего микроскопа впервые были

Klin Dermatol Venerol 2008;5:10-15

опубликованы различимые изображения клеток, полученные с помощью данного метода . Развитие компьютерных и лазерных технологий в 70-80-х годах прошлого столетия, а также возможность получения цифровых изображений привели к росту интереса к конфокальной микроскопии . И в 80-х годах несколько групп исследователей продемонстрировали использование тандемного сканирующего конфокального микроскопа для изображения тканей человека и животных in vivo . Вскоре после того как закончился патент M. Minsky, чертежи конфокального лазерного сканирующего микроскопа были использованы несколькими исследователями для создания рабочих аппаратов. Голландский физик G.F. Brakenhoff разработал конфокальный сканирующий микроскоп в 1979 г. , почти одновременно с ним C. Sheppard внес свой вклад в метод теорией создания изображения . T. Wilson, W. Amos и J. White разработали концепцию и позднее, в 80-х годах прошлого столетия, продемонстрировали полезность конфокальных изображений в исследовании флюоресцирующих биологических образцов . Первый коммерчески доступный аппарат появился в 1987 г. В 90-х годах достижения в оптике и электронике позволили создать более мощные и надежные лазеры, сканирующие зеркальные элементы с высоким коэффициентом полезного действия, высокопроизводительную волоконную оптику, более тонкий слой диэлектрического покрытия и детекторы, уменьшившие шумовые характеристики . Благодаря появившимся в конце 90-х годов высокоскоростным компьютерным системам, увеличенным мониторам и технологиям, позволяющим запоминать большой объем информации, наступил новый взрывной этап в развитии КЛСМ по количеству применений, на которые она могла быть

нацелена. Первые сообщения о применении конфокального лазерного сканирующего микроскопа для получения изображений кожи человека in vivo были опубликованы в 1995 г. . Отражательная конфокальная микроскопия, применяемая в дерматологии, была разработана М. Rajadhyaksha и соавт. и улучшена «Lucid Inc» . В 90-х годах группы исследователей (S. Gonzalez и соавт.) занимались изучением различных патологических состояний кожи с помощью отражательной конфокальной микроскопии и показали большую значимость данного метода как полезного диагностического инструмента .

В зависимости от применяемого источника света существуют разные виды конфокальной микроскопии. Конфокальная микроскопия может выполняться с использованием лазера в качестве источника света или без него. В тандемном сканирующем конфокальном микроскопе обычно используется ртутная лампа. По сравнению с тандемным сканирующим конфокальным микроскопом при КЛСМ используется лазерный луч определенной длины волны и высокой мощности освещения . Кроме того, различают флюоресцентную и отражательную КЛСМ. Благодаря своей безопасности и неинвазивности прижизненная отражательная КЛСМ является более предпочтительной в использовании .

Основной принцип отражательной КЛСМ основан на использовании точечного источника света (лазерный луч), освещающего маленькое пятно внутри ткани, с последующим улавливанием отраженного света через оптически соединенную апертуру (вкрапление) (рис. 1). Отраженный свет проходит через вкрапление, в результате чего только находящийся в фокусе свет достигает детектора, в то время как свет вне фокуса отклоняется. Таким образом, определяется единственный план внутри образца, который расположен в фокусе. Числовая апертура линзы объектива, длина волны и размер открытой апертуры (вкрапления) определяют разрешение изображения, получаемого с помощью отражательной КЛСМ. Лазеры различных длин волн могут быть использованы в качестве источника света для отражающей конфокальной микроскопии. Более длинные, близкие к инфракрасным, длины волн проникают глубже в кожу, но дают более низкое разрешение по сравнению с короткими длинами волн видимого спектра. Отражение света возникает в результате местных различий в коэффициенте преломления внутри ткани. Для отдельных органелл и структур оно обусловлено разницей в коэффициентах преломления по сравнению с ближайшим окружением. Меланосомы дают сильное отражение с длинами волн видимого (400-700 нм) и близкого инфракрасного (700-1064 нм) спектров из-за высокого индекса преломления по сравнению с окружающим эпидермисом. Поэтому клетки, содержащие

Рис. 1. Схема работы конфокального лазерного сканирующего микроскопа.

меланин, такие как базальные кератиноциты и меланоциты, дают яркое изображение .

Существуют конфокальные сканирующие лазерные микроскопы различных фирм-произво- дителей: Vivascope 1000, 1500, 2500 Lucid Inc., Rochester, NY; Optiscan F900, Optiscan Pty. Ltd., Notting Hill, VIC, Australia и др. (рис. 2). При использовании конфокального лазерного микроскопа Vivascope 1500, Lucid Inc. лазерное сканирование осуществляется на длине волны 830 нм с оптической мощностью не более 16 мВт, которое не вызывает повреждения ткани или поражение глаза. Линза объектива дает 30-кратное увеличение (NA 0,9), при этом боковое разрешение составляет приблизительно 1 мкм и осевое разрешение (сечение толщины) 5 мкм. В микроскопе используется водная иммерсионная линза, так как коэффициент преломления воды близок к коэффициенту преломления эпидермиса , и это сводит к минимуму сферическую аберрацию, вызванную поверхностными эпидермальными слоями клеток, когда воспроизводится изображение глубже в дерме. Сканирование производится в плоскостях XY 4×4 мм с размером кадра 0,5×0,5 мм, частотой 9 кадров в секунду. С помощью этой системы можно получить изображение нормальной кожи на глубине от 200 до 400 мкм, достаточной для изображения эпидермиса и верхней части дермы (сосочковой и верхней ретикулярной). Отсканированное через иммерсионный объектив Lucid Stable View изображение с разрешением 1000×1000 точек обрабатывается программой

КЛИНИЧЕСКАЯ ДЕРМАТОЛОГИЯ И ВЕНЕРОЛОГИЯ 5, 2008

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Рис. 2. Конфокальный лазерный сканирующий микроскоп VivaScope 1500 «Lucid Inc».

Vivascope Ver.7,0 и передается на цветной монитор 19′′, имеющий максимальное разрешение 1280×1024 точек . При использовании микроскопа Vivascope 1500 не нужно применять контрастные вещества. Получение изображений возможно благодаря естественному контрасту и различиям в коэффициенте рефракции компонентов кожи, таких как меланин и кератин . Во время воспроизведения изображения используется специальное устройство для контакта с кожей, чтобы уменьшить образование артефактов. Оно содержит воду или гель на границе раздела фаз. Это устройство состоит из металлического кольца, которое фиксируется на коже пациента путем прилипания и соединяется с микроскопом, снабженным магнитом. Данное устройство имеет вогнутую форму, для того чтобы вмещать иммерсионную среду.

Метод КЛСМ позволяет получать изображения эпидермиса и поверхностной части дермы с разрешением, приближенным к традиционной световой микроскопии. С помощью данного метода можно получить изображения не только придатков кожи, но и отличить клетки различных слоев эпидермиса, волокна сосочкового слоя дермы, оценить состояние капилляров дермы. Можно исследовать морфологию разных клеток, определять размер, форму клеточных и субклеточных структур . Основное отличие КЛСМ от традиционного гистологического исследования заключается в том, что

получаемые изображения слоев кожи ориентированы горизонтально (параллельно) поверхности кожи (en face ), а также они представляют собой полутоновые изображения . В связи с этим могут возникать затруднения в трактовке полученных результатов и при сравнении изображений, полученных с помощью прижизненной КЛСМ и данными классической биопсии. С помощью КЛС микроскопа могут быть получены отдельные изображения сечений кожи, а также записаны небольшие кинофильмы для демонстрации динамических процессов, происходящих в коже, например кровотока .

Основными преимуществами прижизненной КЛСМ являются быстрота получения результата обследования по сравнению с классическим патогистологическим исследованием, которое включает в себя этапы иссечения маленького кусочка ткани (биопсию), фиксацию, нарезание на тонкие слои (сечения), окрашивание красителями и последующее изучение с помощью световой микроскопии. КЛСМ не изменяет ткани в ходе исследования, как это имеет место при гистологическом исследовании в результате получения сечений и их окрашивания, таким образом, минимизируется появление артефактов. Кроме того, процедура безболезненна, проходит без повреждения кожных покровов, не оставляет рубцовые изменения. Метод позволяет оценивать динамику заболеваний, а также дает возможность оперировать в режиме реального времени (при микрографической хирургии) .

Первые работы по применению КЛСМ в дерматологии были связаны с получением конфокальных изображений структуры здоровой кожи и последующим их анализом. В работах M. Rajadhyaksha, S. Gonzalez и соавт. , M. Huzaira и соавт. , K.J. Busam и соавт. приводятся подробные описания конфокальных изображений отдельных слоев эпидермиса, дермы, сосудистой сети, придатков кожи (отдельные сальные железы, сально-волосяные фолликулы, потовые протоки). Помимо качественных характеристик, даются морфометрическая оценка размеров клеток, глубины расположения и толщины слоев эпидермиса, оценка отдельных волокон и пучков коллагена сосочковой и верхней части ретикулярной дермы, приведены диаметр просветов капилляров, а также размеры отдельных клеток крови в просветах капилляров. K.J. Busam и соавт. , T.Yamashita и соавт. в своих статьях дают качественную оценку меланоцитам, приводят морфологические признаки меланоцитов, пигментированных кератиноцитов, меланофагов, позволя-

КЛИНИЧЕСКАЯ ДЕРМАТОЛОГИЯ И ВЕНЕРОЛОГИЯ 5, 2008

ющие различать указанные клетки на изображениях, полученных методом прижизненной КЛСМ. В ряде представленных работ дается оценка топографических особенностей строения здоровой кожи, проводится анализ возрастных изменений кожных покровов, влияния инсоляции на строение эпидермиса и дермы здоровых людей. Понимание того, как выглядят изображения здорового эпидермиса и дермы, имеет значение для последующего определения патологических изменений в коже.

Большое количество меланина, представленного в меланоцитарных очагах, делает пигментные новообразования кожи (невусы, меланома) идеальными для изображения и диагностики методом прижизненной КЛСМ . Целью любого визуализирующего метода, применяемого в дерматологии, является диагностика меланомы на ранних стадиях заболевания, так как от этого зависит эффективность проводимой терапии. Результаты исследований K.J. Busam и соавт. , G. Pellacani и соавт. , R. Langley и соавт. , A. Gerger и соавт. показали, что меланома может быть достаточно успешно диагностирована с помощью метода КЛСМ. Наличие плеоморфных ярких клеток внутри эпидермиса и дермы, которые могут быть звездообразной формы, обладать крупными ветвящимися отростками и эксцентрично расположенными крупными ядрами, а также нарушение архитектоники шиповатого слоя за счет нечетких границ клеток и ярких серых частиц (вероятно, меланина), распространенных внутри эпидермиса, позволяет диагностировать меланому . Внутриэпидермальная меланома также может быть диагностирована с помощью данного метода на основании критериев, которые применяются в традиционной гистологии. Конфокальные изображения внутриэпидермальных меланом позволили выявить увеличенное число интрадермальных увеличенных (атипичных) меланоцитов в солитарных единицах во всех слоях эпидермиса, включая верхние зернистый и шиповатый слои . Необходимо указать, что некоторые признаки меланом могут быть определены и в беспигментных меланомах . Однако следует отметить, что малые размеры выборок, на которых были проведены исследования, пока не позволяют судить о чувствительности и специфичности представленных критериев конфокальных изображений в постановке диагноза меланомы.

K.J. Busam и соавт., R. Langley и соавт. указывают на такие признаки меланоцитарных невусов на конфокальных изображениях, как наличие маленьких мономорфных круглых или овальных, сильно преломляющих свет клеток с центрально расположенными ядрами. Эти клетки могут быть видны внутри эпидермиса, в дермоэпидермальном соединении, типично окружая дермальный сосочек, и в поверхностной дерме в зависимости от вида невуса.

Они часто сгруппированы в круглые кластеры (гнезда), содержащие несколько клеток, расположенные вблизи кровеносных сосудов. Архитектура рогового, зернистого, шиповатого и базального слоев при этом остается неизмененной . Диспластические невусы характеризуются локальным уменьшением границ взаимодействия между кератиноцитами в дермоэпидермальном соединении, наличием характерных ярких гранул внутри эпидермиса (вероятно, меланиновых телец), большим разнообразием в размерах и форме невомеланоцитов, хотя они все еще имеют склонность быть более круглыми или овальными, чем ветвящимися. Приведенные исследования свидетельствуют о том, что признаки меланоцитарных невусов хорошо коррелируют с традиционной гистологической картиной. Однако остается до конца неизвестным, можно ли точно определить данным методом злокачественные клетки с малым количеством пигмента. Для выяснения этого вопроса необходимо проведение дальнейших исследований.

Метод прижизненной КЛСМ позволяет определять атипичные области, подозрительные в отношении неопластических очагов. В проанализированной литературе работы, посвященные изучению актинического кератоза, принадлежат D. Aghassi и соавт. , изучению плоскоклеточной карциномы - M. Horn и соавт. , исследованию базалиомы - M. Goldgrier и соавт. , A.L. Agero и соавт. , S. Nori и соавт. , K. Sauermann и соавт. . КЛСМ позволяет определять границы очага до начала терапии, что может быть полезным в оценке границ опухолей с радиальным характером роста, включая злокачественную лентиго-меланому, некоторые базалиомы или опухоли, трудные для клинического осмотра, например, склерозирующие инфильтративные базалиомы. Ключевые гистопатологические признаки актинического кератоза, выявляемые с помощью КЛСМ, включают архитектурный беспорядок, увеличение ядер эпидермиса с плеоморфизмом, паракератоз, что ведет к организованному беспорядку. В настоящее время глубина проникновения лазера является главным ограничением КЛСМ для диагностики актинического кератоза . Конфокальными признаками базалиомы - наиболее часто встречающейся опухоли кожи человека, являются островки мономорфных опухолевых клеток вытянутой формы с характерными вытянутыми ядрами, ориентированными вдоль той же самой оси. Эта картина однообразно ориентированных клеток проходит через всю толщу эпидермиса, теряя нормальную, напоминающую пчелиные соты модель, и архитектуру дермальных сосочков. Обильные кровеносные сосуды, демонстрирующие чрезмерную извилистость, также как и преимущественно мононуклеарный воспалительный инфильтрат, смешанны или тесно расположены с клетками базалиомы

КЛИНИЧЕСКАЯ ДЕРМАТОЛОГИЯ И ВЕНЕРОЛОГИЯ 5, 2008

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Результаты выполненного S. Nori и соавт. большого ретроспективного многоцентрового исследования показали значимую точность признаков, выявляемых при КЛСМ, для диагностики базалиомы in vivo . Таким образом, КЛСМ позволяет в реальном времени определить наличие резидуальной или клинически сомнительной базалиомы. По данным ряда исследований, КЛСМ помогает в скорой оценке границ опухолей при микрографической хирургии в ходе исследования эксцизионных образцов во время операции . Ограничивающими факторами в использовании прижизненной КЛСМ для диагностики опухолей кожи в настоящее время являются ограниченная глубина исследования, которая препятствует получению точных изображений ниже поверхностной дермы, и наличие преломляемости воспалительных клеток, среди прочих.

Выполненные в 90-х годах рядом исследователей (S. Gonzalez и др.) работы по изучению различных воспалительных состояний кожи с помощью отражательной конфокальной микроскопии позволили выявить большую значимость данного метода как полезного диагностического инструмента . Наибольшее преимущество метода заключается в том, что он позволяет в реальном времени оценивать динамические процессы при воспалительных заболеваниях кожи и, что очень важно, оценивать эффективность проводимой терапии дерматозов . С помощью прижизненной КЛСМ оценены воспалительные изменения при псориазе , аллергическом и простом контактном дерматитах , фолликулите , дерматомикозах , бородавках , простом герпесе , системном склерозе . На конфокальных изображениях признаки вульгарного псориаза в стационарной стадии соответствуют обычной гистологической картине и включают паракератоз, микроабсцессы Мунро, акантоз, расширение капилляров, папилломатоз . Отчетливо видны границы воспалительного очага . С помощью КЛСМ в режиме реального времени визуализируются такие типичные признаки контактного дерматита, как спонгиоз, образование микровезикул, воспалительный инфильтрат и местами эпидермальный некроз . С использованием данного метода были продемонстрированы патогистологические особенности простого и аллергического дерматитов, а также показано, что конфокальная микроскопия может применяться для оценки расовых (у представителей негроидной и европеоидной расы) особенностей острого контактного дерматита . Конфокальная лазерная сканирующая микроскопия позволяет быстро, в реальном времени обнаруживать ветви гиф и воспалительный инфильтрат in vivo или iv vitro с ногтевых пластинок и кусочков кожи . Фолликулит, изображенный с помощью конфокальной микроскопии, может быть окончательно диагностиро-

ван путем прямой демонстрации внутриэпидермальных пустул, воспалительного инфильтрата, спонгиоза и дилатации капилляров . Бородавки на конфокальных снимках характеризуются гиперкератотическим роговым слоем и наличием множественных сильно преломляющих округлых структур размером 20-40 мкм внутри очага, что позволяет быстро и окончательно поставить диагноз . Герпетической инфекции кожи соответствуют плеоморфные баллонирующие кератиноциты и многоядерные гигантские клетки в свободной совокупности с кератиноцитами и воспалительными клетками .

Таким образом, метод прижизненной КЛСМ позволяет in vivo оценивать патоморфологические изменения в коже при различных дерматозах, включая неопластические очаги, меланоцитарные невусы, меланому, что, несомненно, подтверждает полезность данного инструмента в диагностике различных дерматологических заболеваний. Учитывая неинвазивный характер метода, возможность повторного многократного исследования одних и тех же очагов, представляется, что КЛСМ в большей степени полезна при оценке динамических изменений, происходящих в коже в ходе эволюции заболеваний и на фоне проводимой терапии дерматозов.

Несмотря на явные полезные стороны прижизненной КЛСМ, существуют также некоторые ограничения и сложности в применении данного метода. Настоящая техника сложна и затратна, и поэтому не очень широко доступна исследователям и клиницистам. Тем не менее несколько групп ученых в институтах и в промышленности разрабатывают более простые, менее затратные сканирующие технологии. Разрабатываются также более портативные аппараты по сравнению с ныне существующими, так как громоздкие установки неудобны в использовании при обследовании труднодоступных областей тела. Ограничивающим фактором в использовании прижизненной КЛСМ является ограниченная глубина исследования, которая препятствует получению точных изображений ниже поверхностной дермы. Продолжается работа по созданию вертикально ориентированных сечений, которые были бы сходны с теми, что мы видим при гистологическом исследовании, так как это значительно бы увеличило возможности прижизненной КЛСМ. Большую научную проблему составляет трактовка изображений

Способность читать, интерпретировать и анализировать конфокальные изображения с тем, чтобы выделить полезную клиническую и гистологическую информацию. Несколько групп ученых по всему миру выполняют детальные исследования, чтобы характеризовать конфокальные изображения и провести их корреляцию с гистологией. Одной из важных проблем остается определение чувствительности и специфичности данного метода исследования в диагностике разных дерматозов .

КЛИНИЧЕСКАЯ ДЕРМАТОЛОГИЯ И ВЕНЕРОЛОГИЯ 5, 2008

ЛИТЕРАТУРА

1. Abramovits W., Stevenson L.C. Changing paradigms in dermatology: new ways to examine the skin using noninvasive imaging methods. Clinics in Dermatology 2003; 21: 353-358.

2. Minsky M. Microscopy apparatus. US Pat 1961; 467.

3. Minsky M. Memoir on inventing the confocal scanning microscopy. Scanning 1988; 10: 128-138.

4. Egger M.D., Petran M. New reflected-light microscope for viewing unstained brain and ganglion cells. Science 1967; 157: 305-307.

5. Davidovits P., Egger M.D. Photomicrography of corneal endothelial cells in vivo. Nature 1973; 244: 366-367.

6. Amos W.B., White J.G. How the confocal laser scanning microscope entered biological research. Biology of the Cell 2003; 95: 335-342.

7. Brakenhoff G.J., Blom P., Barends P. Confocal scanning light microscopy with high aperture immersion lenses. J Microscopy 1979; 117: 219- 232.

8. Sheppard C.J.R., Wilson T. Effect of spherical aberration on the imaging properties of scanning optical microscopes. Applied Optics 1979; 18: 1058.

9. Hamilton D.K., Wilson T. Scanning optical microscopy by objective lens. Scanning, Journal of Physics E: Scientific Instruments 1986; 19: 52-54.

10. Pawley J.B. Handbook of biological confocal microscopy. New York: Plenum Press 1995.

11. Gonzalez S., Swindells K., Rajadhyaksha M., Torres A. Changing paradigms in dermatology: confocal microscopy in clinical and surgical dermatology. Clin Derm 2003; 21: 359-369.

12. Rajadhyaksha M., Grossman M., Esterowitz D. et al. In vivo confocal scanning laser microscopy of human skin: melanin provides strong contrast. J Invest Dermatol 1995; 104: 946-952.

13. Rajadhyaksha M., Gonzalez S., Zavislan J.M. Son R.R. et al. In vivo confocal scanning laser microscopy of human skin II: advances in instrumentation and comparison to histology. J Invest Dermatol 1999; 113: 101-112.

14. Confocal laser microscope images tissue in vivo. Laser Focus World 1997; 33: 119-127.

15. Rajadhyaksha M., Zavislan J.M. Confocal reflectance microscopy of unstained tissue in vivo. Retinoids 1998; 14: 26-30.

16. Gonzalez S., Rajadhyaksha M., Anderson R.R. Non-invasive (realtime) imaging of histologic margin of a proliferative skin lesion in vivo. J Invest Dermatol 1998; 111: 538-539.

17. Gonzalez S., Gonzalez E., White W.M. et al. Allergic contact dermatitis: correlation of in vivo confocal imaging to routine histology. J Am Acad Dermatol 1999; 40: 708-713.

18. Swindle L.D., Thomas S.G., Freeman M., Delaneyz P.M. View of normal human skin in vivo as observed using fluorescent fiber-optic confocal

microscopic imaging. J Invest Dermatol 2003; 121: 706- 712.

19. Delaney P.M., Harris M.R., King R.G. Novel microscopy using fiber optic confocal imaging and its suitability for subsurface blood vessel imaging in vivo. Clin Exp Pharmacol Physiol 1993; 197: 20.

20. Busam K.J., Charles C., Lohmann C.M. et al. Detection of intraepidermal malignant melanoma in vivo by confocal scanning laser microscopy. Melanoma Research 2002; 12: 349-355.

21. Aghassi D., Anderson R.R., González S. Confocal laser microscopic imaging of actinic keratoses in vivo: a preliminary report. J Am Acad Dermatol 2000; 43: 42-48.

22. Руководство по эксплуатации VivaScope 1500 Lucid Inc.

23. Corcuff P., Bertrand C., Leveque J.L. Morphometry of human epidermis in vivo by real-time confocal, microscopy. Arch Dermatol Res 1993; 285: 475-481.

24. Meyer L.E., Otberg N., Richter H., Sterry W. et al. New prospects in dermatology: fiber-based confocal scanning laser microscopy. Laser Physics 2006; 16: 5: 758-764.

25. Serup J., Jemec G.B.E., Grove G.L. Handbook of non-invasive methods and the skin. 2nd ed. CRC Press 2006; 32: 267-276.

26. Huzaira M., Rius F., Rajadhyaksha M., Anderson R.R. et al. Topographic variations in normal skin, as viewed by in vivo reflectance confocal microscopy. J Invest Dermatol 2001; 116: 846-852.

27. Busam K.J., Charles C., Lee G., Halpern A.C. Morphologic features of melanocytes, pigmented keratinocytes and melanophages by in vivo

confocal scanning laser microscopy. Mod Pathol 2001; 14: 9: 862- 868.

28. Yamashita T., Kuwahara T., Gonzalez S., Takahashi M. Non-invasive visualization of melanin and melanocytes by reflectance-mode confocal microscopy. J Invest Dermatol 2005; 124: 235-240.

29. Sauermann K., Clemann S., Jaspers S., Gambichler T. et al. Age related changes of human skin investigated with histometric measurements by confocal laser scanning microscopy in vivo. Skin Research and Technology 2002; 8: 52-56.

30. Sauermann K., Jaspers S., Koop U., Wenck H. Topically applied vitamin C increases the density of dermal papillae in aged human skin. BMC Dermatology 2004; 4:13 doi:10.1186/1471-5945-4-13.

31. Pellacani G., Cesinaro A.M., Seidenari S. Reflectance-mode confocal microscopy of pigmented skin lesions-improvement in melanoma diagnostic specificity. J Am Acad Dermatol 2005; 53: 979-985.

32. Langley R.G.B., Rajadhyaksha M., Dwyer P.J., Sober A.J. et al. Confocal scanning laser microscopy of benign and malignant melanocytic skin lesions in vivo. J Am Acad Dermatol 2001; 45: 365-376.

33. Gerger A., Koller S., Kern T., Massone C. et al. Diagnostic applicability of in vivo confocal laser scanning microscopy in melanocytic skin tumors. J Invest Dermatol 2005; 124: 493-498.

34. Busam K.J., Hester K., Charles C. et al. Detection of clinically amelanotic malignant melanoma and assessment of its margins by in vivo confocal scanning laser microscopy. Arch Dermatol 2001; 137: 923-929.

35. Horn M., Gerger A., Koller S. et al. The use of confocal laser-scanning microscopy in microsurgery for invasive squamous cell carcinoma. British Journal of Dermatology 2007; 156: 81-84.

36. Goldgrier M., Fox C.A., Zavislan J.M. et al. Noninvasive imaging, treatment and microscopic confirmation of clearance of basal cell carcinoma. Dermatol Surg 2003; 29: 205-210.

37. Agero A.L.C., Busam K.J., Benvenuto-Andrade C. Reflectance confocal microscopy of pigmented basal cell carcinoma. J Am Acad Dermatol 2006; 54: 638-643.

38. Nori S., Rius-Dıaz F., Cuevas J. et al. Sensitivity and specificity of reflectance-mode confocal microscopy for in vivo diagnosis of basal cell сarcinoma: a multicenter study. J Am Acad Dermatol 2004; 51: 923-930.

39. Sauermann K., Gambichler T., Wilmert M. et al. Investigation of basal cell сarcinoma by confocal laser scanning microscopy in vivo. Skin Research and Technology 2002; 8: 141-147.

40. Gonzalez S., Sackstein R., Anderson R.R., Rajadhyaksha M. Real-time evidence of in vivo leukocyte trafficking in human skin by reflectance confocal microscopy. J Invest Dermatol 2001; 117: 2: 384-386.

41. González S., Rajadhyaksha M., Rubinstein G., Anderson R.R.

Characterization of psoriasis in vivo by reflectance confocal microscopy. J Med 1999; 30: 337-356.

42. Astner S., Gonzalez E., Cheung A.C. et al. Non-invasive evaluation of the kinetics of allergic and irritant contact dermatitis. J Invest Dermatol 2005; 124: 351-359.

43. Hicks S.P., Swindells K.J., Middelkamp-Hup M.A. et al. Confocal histopathology of irritant contact dermatitis in vivo and the impact of skin color (black vs white). J Am Acad Dermatol 2003; 48: 727-734.

44. Gonzalez S., Rajadhyaksha M., Gonzalez-Serva A. et al. Confocal reflectance imaging of folliculitis in vivo: correlation with routine histology. J Cutan Pathol 1999; 26: 201-205.

45. Markus R., Huzaira M., Anderson R.R., Gonzalez S. A better potassium hydroxide preparation? In vivo diagnosis of tinea with confocal microscopy. Arch Dermatol 2001; 137: 1076-1078.

46. Hongcharu W., Dwyer P., Gonzalez S., Anderson R.R. Confirmation of onychomycosis by in vivo confocal microscopy. J Am Acad Dermatol 2000; 42: 214-216.

47. Goldgeier M., Fox C.A., Muhlbauer J.E. Immediate noninvasive diagnosis of herpesvirus by confocal scanning laser microscopy. J Am Acad Dermatol 2002; 46: 783-785.

48. Sauermann K., Gambichler T., Jaspers S. et al. Histometric data obtained by in vivo confocal laser scanning microscopy in patients with systemic sclerosis. BMC Dermatology 2002; 2: 8.

КЛИНИЧЕСКАЯ ДЕРМАТОЛОГИЯ И ВЕНЕРОЛОГИЯ 5, 2008

Введение.

Конфокальный микроскоп отличается от "классического" оптического микроскопа (см. ) тем, что в каждый момент времени регистрируется изображение одной точки объекта, а полноценное изображение строится путем сканирования (движения образца или перестройки оптической системы). Для того, чтобы регистрировать свет только от одной точки после объективной линзы располагается диафрагма малого размера таким образом, что свет, испускаемый анализируемой точкой (красные лучи на рис. 1б ), проходит через диафрагму и будет зарегистрирован, а свет от остальных точек (например, синие лучи на рис. 1б ) в основном задерживается диафрагмой. Вторая особенность состоит в том, что осветитель создает не равномерную освещенность поля зрения, а фокусирует свет в анализируемую точку (рис. 1в) . Это может достигаться расположением второй фокусирующей системы за образцом, но при этом требуется, чтобы образец был прозрачным. Кроме того, объективные линзы обычно сравнительно дорогие, поэтому использование второй фокусирующей системы для подсветки мало предпочтительно. Альтернативой является использование светоделительной пластинки, так чтобы и падающий и отраженный свет фокусировались одним объективом (рис. 1г) . Такая схема к тому же облегчает юстировку.

Рис. 1а. Ход лучей в обычном оптическом микроскопе, когда в фотоприемное устройство попадает свет из различных точек образца.

Рис. 1б. Применение диафрагмы позволяет существенно снизить фоновую подсветку от точек образца вне анализируемой области.

Рис. 1в. Дополнительное повышение контраста достигается применением подсветки, фокусирующей свет в анализируемую точку.

Рис. 1г. Схема со светоделительной пластинкой упрощает конструкцию микроскопа и процесс юстировки за счет двойного использования объектива
(для подсветки и сбора отраженного сигнала).

Разрешение и контрастность в конфокальном микроскопе.

Рассмотрим теперь математически, каким образом и насколько количественно изменяется контрастность при применении конфокальной микроскопии. Во-первых, так как в конфокальном микроскопе свет дважды проходит через объектив, то функция размытия точки (далее обозначаемая PSF, см. определение в ) имеет вид

Для качественного понимания удобно рассматривать каждую PSF как вероятность того, что фотон попадет в точку с координатами , либо что фотон будет зарегистрирован из точки с координатами , тогда конфокальная PSF есть произведение независимых вероятностей. На рис. 2 приведено изображение обычной PSF и конфокальной PSF.

Рис. 2. Конфокальная PSF показана справа, а обычная PSF – слева .

Если использовать критерий Релея для разрешения (провал 26% от максимума распределения), то мы получим, что разрешение в конфокальном микроскопе увеличивается, но не существенно. Для конфокального микроскопа

в то время как для обычного микроскопа

Однако основным достоинством конфокального микроскопа является не увеличение разрешения в смысле критерия Релея, а существенное увеличение контрастности. В частности для обычной PSF в фокальной плоскости отношение амплитуды в первом боковом максимуме к амплитуде в центре составляет 2%, для случая конфокального микроскопа это отношение будет 0.04%. На рис. 3 приведен практический пример, когда это важно. На верхней части рисунка мы видим, что тусклый объект (интенсивность в 200 раз меньше, чем у яркого) не возможно обнаружить в обычный микроскоп, хотя расстояние между объектами существенно больше того, что предписано критерием Релея. В то же самое время, в конфокальный микроскоп (нижняя часть рисунка 3) данный объект должен хорошо регистрироваться.

Рис. 3. Распределение интенсивности для случая обычного микроскопа (верхний рисунок) и конфокального микроскопа (нижний рисунок).
Максимум интенсивности тусклого объекта в 200 раз меньше, чем интенсивность яркого [1 ].

Распределение интенсивности вдоль оптической оси для конфокального микроскопа определяется выражением

Тогда пользуясь критерием Релея получим разрешение вдоль оптической оси

Здесь важно отметить, что не следует путать разрешение вдоль оптической оси и глубину фокуса в обычном микроскопе. Обычно глубина фокуса в сотни раз превышает разрешение вдоль оптической оси.

Влияние диафрагмы в фокальной плоскости.

Один из параметров, который никак не фигурировал в данном выше описании - это размер диафрагм в фокальной плоскости облучающей и собирающей линз. Отметим, что при анализе мы молчаливо предполагали источник точечным и именно в этом предположении получили функцию размытия точки (PSF) для обычного и конфокального микроскопа. Полученные PSF описывают свойства объективной линзы, а изображение диафрагмы в плоскости объекта определяет, свет из каких областей регистрируется фотодетектором. Очевидно, однако, что уменьшение размера диафрагмы приводит к уменьшению количества проходящего света, увеличивает уровень шума и, в конечном итоге, может свести на нет все достигнутые преимущества по контрастности. Таким образом, стоит вопрос об оптимальном выборе размера диафрагмы и разумном компромиссе.

Диафрагма с отверстием меньше размера пятна Эйри просто приводит к потере интенсивности и никак не влияет на разрешение. Диафрагма размером в одно пятно Эйри позволяет по максимуму использовать разрешающую способность объективной линзы. Однако размер диафрагмы примерно в 3-5 раза больше пятна Эйри представляется наиболее подходящим компромиссом. Следует понимать, что обсуждаемый здесь размер имеет смысл размера изображения в плоскости объекта, а поэтому реальный размер отверстия в диафрагме зависит от увеличения линзы. В частности, при использовании 100-кратной линзы диафрагма с отверстием 1 мм будет спроецирована в плоскость объекта в круг радиусом 10 мкм.

Для того, чтобы учесть наличие диафрагмы математически и построить новую функцию распределения интенсивности, следует выполнить свертку

а для конфокального микроскопа уже полученную функцию умножать на . Результирующее распределение интенсивности для случая диафрагмы с размером 5 пятен Эйри приведено на рис. 4 .

В этой книге в краткой форме изложен материал, необходимый для освоения современных методов конфокальной лазерной микроскопии. Часть из описанных в тексте практических приемов разработана и усовершенствована авторами издания. Отличительной особенностью данной книги является сочетание ключевых моментов из теории современных методов микроскопии с примерами использования различных приемов конфокальной микроскопии и иммуноцитохимии на практике. В приложениях приводятся необходимые сведения о спектральных характеристиках флуорохромов и протоколы иммуноцитохимических реакций, использованных авторами для получения изображений препаратов и построения трехмерных реконструкций микроскопических объектов. Настоящее руководство может являться справочным пособием для специалистов, применяющих в своей работе флуоресцентные методы и конфокальную микроскопию, а также будет полезно для студентов биологических и медицинских факультетов, изучающих морфологические и нейробиологические дисциплины.

* * *

компанией ЛитРес .

ФЛУОРЕСЦЕНТНАЯ МИКРОСКОПИЯ И КОНФОКАЛЬНАЯ ЛАЗЕРНАЯ МИКРОСКОПИЯ – ПРИНЦИПЫ И ОСНОВНЫЕ МЕТОДЫ

Большинство биологических объектов обладают низким контрастом внутренних структур, которые в основном прозрачны, поэтому возможности их наблюдения методом классической микроскопии светлого поля ограничены. Эта проблема может быть преодолена несколькими путями: применением метода исследования в темном поле, использованием метода фазового контраста, для двулучепреломляющих материалов применяют поляризационный контраст. Основным же методом контрастирования в биологии является окрашивание препаратов веществами, способными связываться с препаратом и поглощать свет или флуоресцировать. Последние называют флуорохромами.

1.1. Основные понятия

Флуорохромы (флуоресцентные красители)1 – это вещества, которые способны связываться с объектом и расходовать часть энергии поглощенного света на флуоресценцию. Под флуоресценцией понимают способность ряда веществ после поглощения света с одной длиной волны излучать свет с другой длиной волны. Напомним, что электроны в атомах расположены на энергетических уровнях; расстояние между уровнями является характеристикой молекулы. При облучении вещества светом возможен переход электронов на более высокий энергетический уровень. Разница энергии между энергетическими уровнями и частота колебаний поглощенного света связаны между собой уравнением Бора (постулат Бора):

где ΔЕ – разность энергий между уровнями; v – частота; λ – длина волны; h – постоянная Планка; с – скорость света.

После поглощения света часть полученной системой энергии расходуется в виде тепла, а часть может быть излучена в виде фотона. Согласно правилу Стокса, длина волны испускаемого света больше, чем длина волны поглощаемого, или, другими словами, максимум спектра излучения сдвинут по отношению к максимуму спектра поглощения в сторону более длинных волн. С физическими основами описанных выше процессов более подробно можно ознакомиться в учебнике Р. Фейнмана (2011).

Каждый флуорохром характеризуется определенным спектром поглощения и испускания. Например, один из самых распространенных флуоресцентных красителей – FITC (fluorescein-5-isothiocyanate) – имеет максимум поглощения l ex = 492 нм, а максимум излучения для него составляет l em = 518 нм. Другой распространенный флуорохром, 5-TAMRA (5-carboxytetramethylrhodamine), имеет l ex = 543 нм и l em = 570 нм. На величину стоксова сдвига также влияет полярность среды, в которой находится флуорохром.

Наиболее интенсивной флуоресценции флуорохрома можно добиться, облучая его светом с длиной волны, близкой к максимуму поглощения, однако возможно перевести флуорофор в возбужденное состояние и при облучении его светом с длиной волны, существенно отличающейся от его максимума поглощения. Например, флуорофор можно перевести в возбужденное состояние двумя или тремя длинноволновыми фотонами (мультифотонное возбуждение), что будет эквивалентно возбуждению одним коротковолновым фотоном. Так, возбуждение двумя или тремя фотонами с длиной волны 900 нм эквивалентно возбуждению одним фотоном с длиной волны 450 или 300 нм.

Еще одной характеристикой флуорохрома является квантовый выход – отношение интенсивности поглощаемого и испускаемого света. Квантовый выход (Q ) может быть выражен через отношение интенсивности флуоресценции (F ) к разности интенсивностей падающего (I 0) и выходящего (I ) световых потоков:

Заметим, что квантовый выход всегда меньше единицы из-за «стоксовских» потерь. В зависимости от квантового выхода флуорохромы разделяют на слабые и сильные. Современные синтетические флуорохромы, как правило, обладают высоким квантовым выходом и являются сильными.

Для характеристики способности флуорохрома поглощать свет определенной длины волны вводят понятие молярного коэффициента экстинкции, который определяется как оптическая плотность одномолярного раствора вещества при толщине светопоглощающе-

го слоя в 1 см. Молярный коэффициент поглощения имеет размерность л ⋅ моль - 1 ⋅ см - 1 . Он зависит от природы вещества и от длины волны проходящего света. Величина, полученная путем перемножения молярного коэффициента экстинкции на величину квантового выхода, характеризует яркость флуоресценции флуорохрома при заданной длине волны. Время облучения, при котором флуорохром теряет 50 % яркости, называют фотостабильностью. «Идеальный» флуорохром должен иметь высокий квантовый выход и хорошую фотостабильность. Современные флуорохромы на основе полупроводниковых нанокристаллов (квантовых точек) по этим показателям на порядок превосходят органические соединения (Олейников В. А., 2011).

Еще один важный параметр - время жизни возбужденного состояния , которое определяется как среднее время нахождения молекулы в возбужденном состоянии до того, как вернуться в основное состояние. Время затухания флуоресценции флуорохрома (τ) описывается формулой:

где Г – константа скорости излучательной дезактивации флуорофора; k – обобщенная константа скорости безызлучательной дезактивации.

Обычно время затухания флуоресценции составляет около 10 нс.

Тушением флуоресценции называют любые процессы, которые уменьшают интенсивность флуоресценции данного вещества. К тушению может приводить множество процессов: химические реакции в возбужденном состоянии, перенос энергии, образование комплексов, тушение при столкновениях. К тушению флуоресценции относятся также процессы кажущегося тушения, которое обусловлено оптическими свойствами образца (высокая оптическая плотность, мутность). Для тушения флуоресценции требуется контакт между молекулами флуорохрома и тушителя. Если тушитель диффундирует к флуорохрому, пока последний находится в возбужденном состоянии, и в результате контакта флуорохром возвращается в основное состояние без излучения фотона, говорят о динамическом тушении. Статическое тушение происходит при образовании нефлуоресцирующего комплекса между флуорохромом и тушителем. При увеличении концентрации флуорохрома возможно самотушение флуоресценции как результат поглощения молекулами вещества собственного излучения. Возможно также поглощение флуоресцентного излучения одного флуорохрома другим. К тушителям флуоресценции относят молекулярный кислород, ароматические и алифатические амины, ксенон, пероксид водорода, акриламид, оксид азота, нитрометан, нитроксиды, хлороформ, трихлорэтанол, бромбензол. Следует отметить, что не все флуорохромы тушатся любыми из вышеперечисленных веществ, однако (в зависимости от условий эксперимента) почти всегда можно подобрать эффективную пару флуорохром-тушитель или, напротив, избежать тушения флуоресценции (что более важно в морфологических исследованиях).

Для флуорохромов характерна анизотропия флуоресценции . Анизотропия – это зависимость свойств вещества от направления. При возбуждении поляризованным светом селективно возбуждаются только те молекулы флуорохрома, для которых дипольный момент перехода при поглощении параллелен электрическому вектору возбуждающего излучения. Такое селективное возбуждение частично ориентированного набора флуорохромов приводит к частично поляризованному испусканию флуоресценции. В общем случае анизотропия флуоресценции r выражается формулой:

где Iv и Ih – интенсивности флуоресценции вертикально и горизонтально поляризованного испускания в случае возбуждения образца вертикально поляризованным светом.

При планировании экспериментов с использованием флуорохромов, особенно флуорохромов нового поколения – квантовых точек – необходимо учитывать возможность мерцания флуоресценции. Это стохастический процесс перехода флуорохрома из флуоресцирующего состояния в состояние отсутствия флуоресценции, несмотря на постоянное возбуждение. В результате, при наблюдении за одиночными флуоресцирующими комплексами возникает стробоскопический эффект (зрительная иллюзия неподвижности или мнимого движения предмета при его прерывистом наблюдении). Кроме этого, поскольку время нахождения флуорохрома во «включенном» и «выключенном» состоянии является случайным, сравнение результатов независимых экспериментов при использовании таких флуорохромов затруднено. При конфокальной микроскопии данный эффект может быть компенсирован за счет линейного или покадрового усреднения сканируемых изображений.

1.2. Устройство флуоресцентного микроскопа

Прототип флуоресцентного микроскопа был разработан в начале ХХ в. Августом Келлером, который при конструировании микроскопа использовал в качестве источника света дуговую кадмиевую лампу. Затем немецкий физик Генри Фридрих Зидентопф, работая в оптических мастерских Цейса (в 1907 – 1938 гг. директор лаборатории микроскопии), совместно с Рихардом Зигмонди изобрел (1903) щелевой ультрамикроскоп. Еще через восемь лет (1911) Oskar Heimstдdt сконструировал первый флуоресцентный микроскоп и применил его для исследования явления автофлуоресценции органических и неорганических объектов. Однако в то время было трудно добиться эффективного разделения флуоресцентного сигнала от возбуждающего света. Эта проблема была преодолена Philipp Ellinger и August Hirt в 1929 г., которым удалось разработать так называемый эпифлуоресцентный микроскоп. В предложенной ими конфигурации микроскопа освещение препарата и детекция флуоресцентного сигнала осуществлялась с одной стороны от образца, поэтому объектива достигал только отраженный возбуждающий и излучаемый свет. Прорыв в развитии флуоресцентной микроскопии связан с появлением лазеров (60-е гг. XX в.), с помощью которых удалось добиться высокой степени пространственной и временной когерентности светового пучка. Кроме того, стало возможным эффективно разделять сигналы, используя дихроичные зеркала.

Принципиальная схема современного флуоресцентного микроскопа представлена на рис. 1.

Свет от источника проходит через фильтр возбуждающего излучения. При этом из спектра выделяются только те компоненты, которые необходимы для возбуждения флуоресценции. Затем свет попадает на дихроичное зеркало (светоделитель). Отраженный светоделителем свет попадает в объектив флуоресцентного микроскопа и фокусируется на образце, возбуждая флуоресценцию. Флуоресцентный сигнал (смещенный в длинноволновую область (согласно Правилу Стокса)) , а также рассеянное излучение возбуждения достигает светоделителя, но, в отличие от возбуждающего света, проходит через дихроичное зеркало, после чего рассеянное излучение отсеивается эмиссионным фильтром и на детектор попадает только излучение флуоресценции.

Источник возбуждающего света. В настоящее время используются три типа источников света: лампы высокой мощности (ртутные, ксеноновые и их аналоги), диоды и лазеры. Ртутная лампа – это газоразрядный источник света, в котором при электрическом разряде в парах ртути под высоким давлением возникает оптическое излучение преимущественно в ультрафиолетовой области спектра. Такие источники света являются малоэффективными, поскольку они производят большое количество избыточной тепловой и световой энергии по сравнению с энергией, требуемой для возбуждения флуоресценции. Флуоресцентные микроскопы могут быть укомплектованы ртутными лампами мощностью 50 – 200 W. Использование более мощной лампы позволяет возбудить с достаточной эффективностью даже слабый флуорохром, но при этом необходимо учитывать, что увеличение мощности лампы влечет за собой увеличение скорости выгорания флуорохромов.

Рис. 1. Принципиальная схема флуоресцентного микроскопа

В ксеноновой лампе вспышка происходит после ионизации газа и прохождении через него мощного импульса электрического тока, поданного на поджигающий электрод. В результате этого электроны в молекуле ксенона занимают орбиты с более высокими энергетическими уровнями и, возвращаясь на прежние орбиты, излучают энергию в виде фотонов. Ксеноновая лампа имеет непрерывный спектр излучения в широком спектральном диапазоне, что не всегда пригодно для возбуждения флуоресценции. Такие лампы обычно используют при работе с флуорохромами, требующими для возбуждения длинноволновый свет (красной и инфракрасной области).

Вместо ртутной или ксеноновой лампы можно использовать металлогалогенную лампу (metal halide lamp ). Это газоразрядная лампа высокого давления. Внутри колбы размещается кварцевая или керамическая цилиндрическая горелка, в которой находятся галогениды некоторых металлов (йодиды натрия, таллия, индия и др.), инертный газ (преимущественно ксенон и аргон) и металлическая ртуть. При подаче на лампу питающего напряжения происходит зажигание дугового разряда, металл начинает испаряться, его атомы возбуждаются, что приводит к возникновению излучения. В зависимости от состава металлов различаются и спектры излучения ламп. Обычно компоненты подбираются так, чтобы компенсировать недостаток красного и желтого света в спектре ртути, что немаловажно при использовании возбуждаемых светом этого диапазона флуорохромов (например, флуоресцеина). Кроме этого, лампы данного типа компактны, экономичны в использовании, для них характерен пониженный уровень тепловой отдачи.

Источник возбуждения флуоресцентного излучения может быть выполнен в виде одного или нескольких светоизлучающих диодов, причем возможно использование диодов, имеющих как одинаковую длину волны излучения, так и различную. Применение светодиодов позволяет избежать нагревания системы, увеличивает срок ее эксплуатации.

Лазеры в качестве источника света используются в основном в сканирующих устройствах для обеспечения высокой интенсивности освещения в узкой спектральной области и на малой площади образца. В таких микроскопах остросфокусированные световые лучи лазера сканируют образец точку за точкой. Поскольку лазеры испускают свет в узкой спектральной области, пропадает необходимость применения возбуждающих светофильтров. Однако при использовании флуорохромов, которые возбуждаются на разных длинах волн, требуется применять разные лазеры или же прибегать к различного рода приемам.

Фильтры.

Фильтр возбуждающего света подбирается таким образом, чтобы он выделял из спектра лампы свет той длины волны, которая максимально эффективно поглощается флуорохромом. Например, выпускаются светофильтры под стандартные флуорохромы для «синей», «зеленой», «красной» люминесценции или под несколько стандартных флуорохромов (например, возбуждающий светофильтр BP 560/40 нм для «красной» люминесценции или возбуждающий светофильтр под несколько флуорохромов BP 370/40, BP 474/28, BP 585/35 нм производства фирмы Carl Zeiss).

Дихроичные зеркала (интерференционные светофильтры) имеют специальное интерференционное покрытие, позволяющее отражать свет, длина волны которого меньше определенного значения, и пропускать излучение с большей длиной волны. В данном случае возбуждающее излучение отражается, а сигнал флуоресценции полностью пропускается. Для получения таких фильтров на поверхность прозрачной пластины наносят несколько (от 10 до 200) слоев материала с чередующимися высоким и низким показателями преломления. Например, PbCl2, TiO2, ZnS (показатель 2,2 – 2,3) и MgF 2 , SiO 2 , Na 3 AlF 6 (показатель 1,3 – 1,4). Толщина каждого слоя тщательно выдерживается (используется техника вакуумного напыления), поскольку этот параметр определяет положение максимума кривой пропускания. От числа слоев зависит ширина зоны пропускания фильтра и степень подавления «ненужной» части спектра.

Запирающие фильтры (band pass BP). При конструировании запирающих фильтров используют комбинацию длинноволновых отрезающих (shot pass filter, или SP filter) и длинноволновых пропускающих (long pass filter, или LP filter) фильтров. Первые задерживают длинноволновый свет, но пропускают коротковолновый, а LP-фильтры, напротив, пропускают длинноволновый свет, задерживая коротковолновый. Комбинируя эти фильтры, можно добиться того, что через фильтр будет проходить только свет определенного участка спектра. Запирающий фильтр выбирают в соответствии с фильтром возбуждающего света. Например, при установке возбуждающего светофильтра BP 560/40 нм используют запирающий светофильтр BP 630/75 нм.

Сближение в пространстве всех светофильтров позволило объединить их в единый светоделительный модуль. Такая конструкция обеспечивает производство легкой замены или смены модуля и дает возможность применять несколько флуорохромов одновременно, с высокой точностью совмещая полученные изображения. При приобретении флуоресцентного микроскопа необходимо серьезно подходить к вопросу о выборе светоделительных модулей, принимая во внимание поставленные задачи и спектральные характеристики имеющихся флуорохромов. Если планируется использовать несколько флуоресцентных красителей, необходимо учитывать, что спектры излучения флуорохромов не должны перекрываться. В противном случае возможны ошибки в интерпретации данных.

Детекторы флуоресцентного сигнала. Усиление и детектирование сигнала производится с помощью фотоэлектронного умножителя (ФЭУ) и цифровой видеокамеры. ФЭУ – это электровакуумный прибор, в котором поток электронов, излучаемый фотокатодом, усиливается в умножительной системе в результате вторичной электронной эмиссии. В результате фотоэффекта при попадании фотона на фотокатод из него вылетают электроны, которые, ускоряясь в электрическом поле, направляются на систему динодов (специальный электрод), где за счет вторичной электронной эмиссии образуют нарастающую (от динода к диноду) электронную лавину, поступающую на анод. Обычно коэффициент усиления ФЭУ (число электронов, достигших анода при выбивании из фотокатода одного электрона) составляет около 10 6 , что позволяет получить на выходе ФЭУ легко регистрируемый сигнал.

Цифровые камеры в качестве светочувствительного элемента имеют CCD-матрицу (charge-coupled device), она же ПЗС-матрица (сокр. от «прибор с зарядовой связью»). CCD-матрица является специализированной интегральной аналоговой микросхемой, которая представляет собой набор резисторов. Количество этих ячеек (элементов) в матрице является основной определяющей разрешения и качества картинки. Принцип работы CCD-матрицы следующий: свет, попавший на матричные элементы, преобразуется в электрический заряд, формируется зарядовая картина, которая пропорциональна освещенности в каждой ячейке. Матрица может «накапливать» заряды в течение определенного периода времени. Общий заряд, накопленный в ячейке, равен произведению зарядов на время экспонирования. Для получения цветной картинки, как правило, световой луч еще проходит через набор специальных светофильтров/призм зеленого, синего и красного цвета. С более подробным описанием принципов работы отдельных модулей флуоресцентного микроскопа можно ознакомиться в пособии В. И. Голышевской [и др.] (2008) и в работе H. C. Ishikawa-Ankerhold (2012).

1.3. Принципы конфокальной микроскопии

Конфокальная микроскопия является разновидностью флуоресцентной микроскопии с улучшенным разрешением вдоль оптической оси объектива, которое достигается за счет использования принципа конфокальной фильтрации флуоресценции. Концепция конфокальной микроскопии была предложена Marvin Minsky в 50-е гг. XX в. для исследования ткани головного мозга без предварительного окрашивания. В разработанном им микроскопе свет последовательно фокусировался на разных точках образца. С целью устранения шумового сигнала от участков, расположенных вне плоскости фокуса, использовалась диафрагма. Она находилась в плоскости, сопряженной с плоскостью фокуса объектива, таким образом, что при проецировании диафрагмы на объект ее изображение точно совпало с фокусом освещающего объект света. При таком устройстве системы свет из областей вне фокуса задерживался диафрагмой и на детектор попадал только сигнал из фокуса объектива. Изменяя диаметр диафрагмы, можно было варьировать толщину оптического слоя вблизи фокуса объектива, от которого измерялся сигнал. Сканирование плоскости образца по точкам позволяло получить полное изображение. Исходя из этого принципа, возникло и название метода – «конфокальный» – основанный на сопряжении фокусов. Однако при таком устройстве микроскопа на изображении было слишком много помех из-за использования слабых источников освещения. Вероятно поэтому изобретение Minsky осталось почти без внимания. Интерес к нему вернулся только после изобретения лазера. Более подробно исторические аспекты создания конфокального микроскопа приведены в обзоре Н. Н. Лукашевой [и др.] (2008).

В современном конфокальном микроскопе источником возбуждающего света является лазер. Преимуществом лазеров по сравнению с ламповыми источниками света заключается в монохроматичности генерируемого света и малой расходимости светового пучка. Монохроматичность возбуждающего флуоресценцию света дает возможность расширить спектральный диапазон регистрируемой флуоресценции и улучшить подавление светорассеяния на длине волны возбуждения. Малая расходимость пучка света способствует более эффективной работе оптической системы микроскопа, уменьшает число бликов, связанных с отклонением света от расчетного оптического пути, улучшает точность фокусировки пучка света и уменьшает объем, в который можно сфокусировать свет на образце. На рис. 2 показана принципиальная схема современного лазерного конфокального микроскопа.

Лазер излучает свет, формируя узкий световой пучок. Затем свет проходит через систему линз (расширитель пучка) и попадает на светоделитель, который отражает возбуждающий свет, направляя его на систему зеркал (на схеме не показана), позволяющих изменять направление луча во взаимно перпендикулярных плоскостях. Светоделитель обеспечивает высокоэффективное отражение света на длине волны генерации лазера и почти стопроцентное пропускание света в остальном спектральном диапазоне. Далее свет через объектив фокусируется в определенной точке образца, возбуждая флуоресценцию. При этом лазерный луч может возбуждать флуоресценцию во всех слоях образца, через которые он проходит, а интенсивность флуоресценции будет возрастать по мере приближения к точке фокусировки. Флуоресцентное излучение собирается объективом и возвращается на светоделитель, проходит сквозь него, попадая на эмиссионные фильтры. Отраженное излучение лазера через светоделитель не проходит. При необходимости многоканальной регистрации (например, при использовании нескольких флуорохромов) возможно дополнительное деление флуоресцентного сигнала на составляющие с помощью дополнительных светоделителей и фильтров эмиссии. Собранный из определенной точки образца свет фокусируется в плоскости конфокальной диафрагмы (pinhole), попадает на детектор (ФЭУ) и оцифровывается. При этом свет, исходящий из областей, находящихся выше или ниже плоскости фокуса, отсекается диафрагмой и на детектор не попадает. После регистрации флуоресцентного сигнала от первой точки фокусировки при помощи системы зеркал луч возбуждающего света перемещается на следующую точку в образце. Весь процесс повторяется. Так, точка за точкой, формируется изображение в горизонтальной (или вертикальной) плоскости.

Рис. 2. Принципиальная схема простейшего конфокального микроскопа

Диаметр конфокальной диафрагмы можно варьировать, тем самым изменяя толщину оптического слоя, от которого регистрируется сигнал. Однако следует понимать, что уменьшение диаметра конфокальной диафрагмы (а, следовательно, и уменьшение толщины оптического слоя) приводит к снижению интенсивности света, который диафрагма пропускает к детектору и, соответственно ухудшению детекции объектов с неяркой флуоресценцией. В связи с этим приходится искать компромисс между разрешением по оси z , зависящим от размера конфокальной диафрагмы, и возможностью регистрации четких флуоресцирующих объектов, что зависит как от размера диафрагмы, так и от степени усиления регистрируемого сигнала.

Помимо диаметра конфокальной диафрагмы толщина оптического слоя зависит от длины волны возбуждающего света, числовой апертуры объектива, показателя преломления иммерсионной среды. В частности, чем больше числовая апертура объектива, тем меньше толщина оптического слоя.

Не менее важным параметром является разрешающая способность микроскопа. Вследствие дифракции света увеличенное изображение объекта может оказаться размытым (две или более точек объекта воспринимаются глазом как одна). Еще в XIX в. Джон Рэлей сформулировал принцип, в соответствии с которым предельное разрешение микроскопа не может быть больше половины длины волны освещающего объект света. Предел разрешения объектива микроскопа (l min) был уточнен немецким физиком Г. Гельмгольцем:

l min = 0,61λ/ n sin α,

где λ -длина волны света; n – показатель преломления иммерсионной среды; α -апертурный угол (максимальный угол, который образуют лучи, попадающие в объектив, с оптической осью системы).

Выражение NА = n sin α называют числовой апертурой.

Согласно формуле Гельмгольца, разрешение объектива микроскопа зависит от длины волны облучающего света и пропорционально числовой апертуре. Повысить разрешение также можно с помощью увеличения коэффициента преломления иммерсионной среды. Поскольку невозможно неограниченно уменьшать длину волны облучающего света и увеличивать числовую апертуру объектива, существует разрешающий предел – около 200 нм. Однако есть возможность улучшить качество изображения за счет увеличения контраста. Если установить диаметр конфокальной диафрагмы равным диаметру центрального пятна дифракционной картины точечного объекта (диску Эйри), то можно избежать попадания в объектив света от дифракционных колец. Применяя такую технологию, можно повысить контрастность примерно в 1,4 раза по сравнению с обычными микроскопами, а это приведет к заметному улучшению качества изображения. Аксиальное разрешение конфокального микроскопа также зависит от диаметра диафрагмы. Чем меньше диаметр диафрагмы, тем меньше толщина слоя, с которого снимается сигнал, следовательно, лучше аксиальное разрешение (свет из соседних точек, находящихся вне фокальной плоскости, задерживается диафрагмой). Величина конфокальной диафрагмы, равная размеру диска Эйри, рассчитывается программой, управляющей конфокальным микроскопом, для каждого сочетания объектива и используемых фильтров (1 Airyunit). Она легко может быть задана без дополнительных вычислений.

С более подробным описанием принципиальной схемы конфокального микроскопа и порядком работы его модулей можно ознакомиться в работах Э. И. Лежнева [и др.] (2001), Г. И. Штейна (2007); R. Y. Tsien (2006); B. J. Nair (2012).

Как указывалось выше, в конфокальной лазерной микроскопии изображение всего образца получают путем сканирования. Скорость поточечного сканирования ограничивает скорость работы микроскопа в целом и делает невозможным наблюдение за быстротекущими процессами. Чтобы избежать этого ограничения, на практике используют не одиночную диафрагму, а массив диафрагм и детекторов. Такие массивы размещают на диске Нипкова. Это устройство, изобретенное Паулем Нипковым в 1884 г., представляет собой вращающийся диск из непрозрачного материала с нанесенными на нем отверстиями одинакового диаметра, расположенными по спирали в один оборот, начиная от наружного края диска. Наблюдая объект через сектор быстро вращающегося диска Нипкова, можно заметить, что происходит его построчное сканирование. При более высокой скорости вращения объект можно увидеть целиком (Феофанов А. В., 2007).

Современный аналог диска Нипкова содержит 20 тыс. отверстий, на которых лазерный луч фокусируется при помощи дополнительного диска с микролинзами. При вращении такого двойного диска достигается считывание до 360 кадров в секунду. Однако стоит отметить, что диаметры отверстий и расстояния между ними на диске фиксированы и подбираются для конкретного объектива, следовательно, смена последнего требует замены диска.

Сегодня на смену вращающимся дискам Нипкова приходят их твердотельные неподвижные аналоги – цифровые микрозеркальные устройства (digital micromirror device, DMD). Эти устройства представляют собой массивы микрозеркал, которые соответствуют пикселям в проецируемом изображении и, отклоняясь в ту или другую сторону, управляют прохождением света. В конфокальной микроскопии они играют роль массива отверстий, фильтрующих возвращаемый образцом сигнал, с изменяемым диаметром и схемой расстановки.

Однако конфокальные микроскопы имеют и существенные недостатки. Так, возбуждение значительной части существующих флуорохромов осуществляется лазерным излучением ультрафиолетового или коротковолнового видимого диапазона, что разрушительно для живых клеток. Эта проблема была преодолена с введением в практику мультифотонных микроскопов, в которых в качестве подсветки используется излучение инфракрасного диапазона.

1.4. Мультифотонная микроскопия

Мультифотонная микроскопия – вариант лазерной сканирующей конфокальной микроскопии, основанный на принципе Гёпперт-Майер, согласно которому с увеличением плотности мощности света возрастает вероятность поглощения атомом флуорохрома одновременно двух и более фотонов, после чего атом излучает фотон большей энергии, чем при однофотонном поглощении. Несмотря на то что это явление было описано еще в 1931 г., первый мультифотонный микроскоп был применен для исследования биологических объектов Winfried Denk лишь в 1990 г. Это было связано с невозможностью до появления лазерной техники достичь на практике излучения большой плотности. В современных мультифотонных микроскопах высокая плотность мощности светового пучка обеспечивается за счет фокусировки лазерного излучения, а также благодаря уменьшению длительности лазерного импульса. Для этой цели применяются фемтосекундные лазеры с длительностью импульса около 10 - 13 с (100 фемтосекунд) и частотой порядка 100 МГц. Использование такой системы (при невысокой ее мощности) позволяет получить сигнал с малым уровнем фоновых шумов, достичь большей глубины проникновения в ткани при малой степени повреждения клеток. Кроме этого за счет отсутствия возбуждения и выцветания флуорохромов вне фокального объема отсутствует необходимость установки конфокальной диафрагмы, поэтому лазерный сканирующий микроскоп с мультифотонным возбуждением не является типичным конфокальным микроскопом. В качестве примера мультифотонного микроскопа можно привести комплекс лазерного сканирующего конфокального микроскопа Carl Zeiss LSM-710 с фемтосекундным инфракрасным лазером с перестраиваемым диапазоном (800 – 1500 нм). Использование этой системы позволяет получить глубину проникновения в ткани порядка 500 мкм и осуществлять непрерывный мониторинг живых объектов в течение нескольких часов.

Одним из вариантов мультифотонной микроскопии является микроскопия с использованием регистрации второй гармоники (Second-harmonic imaging microscopy – SHIM). Метод генерации второй гармоники основан на нелинейном оптическом явлении, суть которого заключается в преобразовании средой двух фотонов с частотой w в один фотон с частотой 2w. Это означает, что помимо света на частоте лазера из среды выходит свет на удвоенной частоте – вторая гармоника. Генерация второй гармоники обусловлена рассеянием света в среде и возможна при действии поляризованного лазерного излучения ближнего инфракрасного диапазона. Подробное изложение физико-химических основ этого процесса приведено в учебнике под редакцией Б. И. Манцызова (2009). Отметим, что не все биологические образцы могут генерировать вторую гармонику. Классическим объектом для этого вида микроскопии является роговица глаза, которая преимущественно состоит из плотно упакованных коллагеновых волокон – источника генерации второй гармоники.

1.5. Конфокальная микроскопия в применении к исследованию динамических процессов и межмолекулярных взаимодействий

1.5.1. Восстановление флуоресценции после фотоотбеливания (Fluorescence Recovery After Photobleachin – FRAP)

Данная техника применяется для исследования подвижности биоорганических молекул, например для измерения коэффициента латеральной диффузии некоторого белка или для изучения полимеризации белков. Основной принцип метода заключается в том, что белок интереса метят флуоресцентной меткой, с помощью ослабленного аттенюаторами возбуждающего излучения регистрируют фоновую флуоресценцию; после этого на короткий промежуток времени (несколько миллисекунд) увеличивают интенсивность облучения, что приводит к выжиганию флуорохрома; затем снижают интенсивность до исходной и регистрируют флуоресценцию с отбеленного участка (Соболев А. С., 2000). Если молекулы с флуорохромом из соседней необлученной зоны (например, посредством диффузии) перемещаются в облученную область, то по времени нарастания флуоресценции можно судить об их подвижности. Несколько лет назад была разработана модификация этого метода – обратный FRAP или iFRAP, который с успехом применяется для изучения подвижности молекул в малом объеме или кинетики диссоциации молекул. В этой модификации фотоотбеливанию подвергаются флуоресцентно меченые молекулы во всей клетке за исключением малого объема, затем регистрируется изменение уровня флуоресценции в этом объеме (Dailey M. E. [еt al.], 2006).

1.5.2. Потеря флуоресценции во время фотоотбеливания (Fluorescence Lossin Photobleaching – FLIP)

Техника FLIP используется для выявления взаимодействий между молекулами из разных компартментов клетки или для изучения подвижности молекулы внутри компартмента. Например, для наблюдения передвижения определенного белка из цитоплазмы в ядро. Эксперименты в технике FLIP отличаются от FRAP и iFRAP тем, что выжигание флуоресценции в одной и той же области образца производится несколько раз с целью предотвращения восстановления флуоресценции в ней. При повторном отбеливании определенной области возникает потеря флуоресценции в пограничной области. По потере флуоресценции в области пограничной с облучаемой можно судить о передвижении фракции меченных флуоресцентным красителем белков и, наоборот, по остаточной флуоресценции можно определить долю неподвижных молекул. FLIP часто используется в комбинации с FRAP, чтобы получить обобщенную информацию об активном и пассивном перемещении меченых белков.

1.5.3. Локализация флуоресценции после фотоотбеливания (Fluorescence Localization After Photobleaching – FLAP)

С помощью метода FLAP можно в реальном времени следить за перемещением флуоресцентно меченой молекулы в пространстве. Техника FLAP была разработана Graham Dunn в 2002 г. и состояла в том, что к молекулам интереса пришивали две различные флуоресцентные метки, одну из которых отбеливали, а с помощью второй следили за перемещением молекулы. Для реализации этого метода оба красителя должны визуализироваться одновременно и независимо, тогда FLAP сигнал получают путем вычитания отбеленного сигнала из неотбеленного для каждого пикселя.

1.5.4. Фёрстеровская (флуоресцентная) резонансная передача энергии (Fӧrster (Fluorescence) Resonance Energy Transfer – FRET)

Фёрстеровская резонансная передача энергии, или иначе диполь-дипольный перенос энергии, – это механизм переноса энергии между двумя молекулами (от донора к акцептору), который происходит без промежуточного испускания фотонов и является результатом диполь-дипольного взаимодействия между донором, находящимся в возбужденном состоянии, и акцептором. Характерная черта данного процесса – тушение флуоресценции донора и возникновение более длинноволновой флуоресценции у акцептора, которая детектируется конфокальным микроскопом. При этом перенос возбуждения сопровождается уменьшением времени жизни и квантового выхода флуоресценции донора, для которого акцептор выступает в роли тушителя. Скорость переноса убывает как r –6 , где r – расстояние между донором и акцептором, что используется для измерения расстояния между двумя молекулами или между двумя метками в одной молекуле. Для характеристики этого явления вводится понятие фестеровского радиуса (R F ) – это эффективное расстояние, на котором скорость перехода составляет 50 % от максимума (для большинства систем его величина составляет 20 – 50 Å). Если расстояние между донором и акцептором превышает 10 нм, то диполь-дипольный перенос энергии не возможен. Помимо расстояния скорость переноса зависит от степени перекрывания спектров испускания донора и поглощения акцептора, от взаимной ориентации диполей донора и акцептора и от времени жизни возбужденного состояния донора в отсутствие акцептора. Константа скорости переноса энергии k et определяется выражением:

где τ d – время жизни возбужденного состояния донора в отсутствие акцептора.

Для реализации технологии FRET необходимо, чтобы:

1) донорный зонд обладал достаточным временем жизни для осуществления переноса энергии;

2) молекулы донора и акцептора располагались на расстоянии 1 – 10 нм друг от друга;

3) спектр поглощения флуорохрома акцептора накладывался на спектр испускания флуоресценции флуорохрома донора (примерно на 30 %);

4) для переноса энергии ориентации диполя донора и акцептора были примерно параллельны друг другу;

5) пары флуорохромов соответствовали имеющимся в конструкции микроскопа лазерам.

Наиболее часто используемые пары донор – акцептор приведены в обзоре, расположенном на сайте http://www.mdpi.com/ 1420-3049/17/4/4047р. 4088.

Существуют несколько методов исследований FRET: фотоотбеливание акцептора/донора; метод спектральной конфокальной микроскопии в применении к FRET; микроскопия для исследования времени жизни флуоресценции (fluorescence lifetime imaging microscopy – FLIM) и метод поляризации флуоресценции (Ishikawa-Ankerhold Н. С. , 2012). В зависимости от задачи данные модификации метода FRET позволяют следить за конформационными изменениями в белках, изучать кинетику ферментативных реакций, исследовать белок-белковые и другие взаимодействия. Например, по изменению FRET-сигнала между Gá иGâã субъединицами G-белка, слитыми с флуоресцирующими белками CFP и YFP, можно охарактеризовать динамические характеристики диссоциации G-белка в живых клетках; две субъединицы никотиновых ацетилхолиновых рецепторов á4 и â2, слитые с YFP и CFP, послужили основой для разработки клеточных систем, на основе которых с применением спектральной конфокальной микроскопии показана возможность измерять уровень á4â2-рецепторов и изучать процессы их сборки-диссоциации под воздействием различных стимулов. С помощью методики FLIM смогли в системе реального времени отслеживать уровень фосфорилированной формы эпидермального фактора роста (ЭФР), для чего к ЭФР пришили GFP, а к антителам, реагирующим с фосфоЭФР, – Cy3 (Grigsby C. L. , 2012; Zeug A. , 2012).

Литература

Голышевская В. И., Егорова О. В., Севастьянова Э. В., Шульгина М. В. Люминесцентная микроскопия: учебное пособие для проведения курсов обучения: «Культуральные методы диагностики туберкулеза», «Выявление туберкулеза методом микроскопии». – М.; Тверь: Триада, 2008. – 36 с.

Лукашева Н. Н., Ткаченко С. Б., Потекаев Н. Н., Кузьмина Т. С., Василевская Е. А. Прижизненная отражательная конфокальная лазерная сканирующая микроскопия: история создания, принцип работы, возможности применения в дерматологии // Клиническая дерматология и венерология. – 2008. – № 5. – С. 10 – 15.

Манцызов Б. И. Когерентная и нелинейная оптика. – М.: ФИЗМАТЛИТ, 2009. – 208 с.

Олейников В. А . Полупроводниковые флуоресцентные нанокристаллы (квантовые точки) в белковых биочипах // Биоорг. химия. – 2011. – 37 (2). – С. 171 – 189.

Сайфитдинова А. Ф. Двумерная флуоресцентная микроскопия для анализа биологических образцов: учебно-методическое пособие. – СПб.: СОЛО, 2008. – 72 с.

Соболев А. С. Как измеряют подвижность макромолекул в живых клетках // Соросовский образовательный журнал. – 2000. – Т. 6. – № 4. – С. 2 – 6.

Феофанов А. В. Спектральная лазерная сканирующая конфокальная микроскопия в биологических исследованиях // Успехи биологической химии. – 2007. – Т. 47. – С. 371 – 410.

Фейнман Р. Фейнмановские лекции по физике:в9 т. – 6-еизд. сущ. испр. – М.: УРСС: Издательский дом «ЛИБРОКОМ», 2011. – Т. 3: Излучение. Волны. Кванты. – 264 с.

Штейн Г. И. Руководство по конфокальной микроскопии. – СПб.: ИНЦ РАН, 2007. – 77 с.

Dailey M. E., Manders E., Soll D., Terasaki M. Chapter 19 Confocal Microscopy of Live Cells In «Handbook of Biological Confocal Microscopy, 3rd Ed.». – New York: Springer, 2006. – Р. 381 – 404.

Grigsby C. L., Ho Y. P., LeongK. W. Understanding nonviral nucleic acid delivery with quantum dot-FRET nanosensors // Nanomedicine (Lond). – 2012. – Vol. 7 (4). – P. 565 – 577.

Ishikawa-Ankerhold H. C., Ankerhold R., Drummen G. P. C. Advanced Fluorescence Microscopy Techniques – FRAP, FLIP, FLAP, FRET and FLIM // Molecules. – 2012. – Vol. 17. – Р. 4047 – 4132.

Nair B. J., Sivakumar T. T., Joseph A. P., Varun B. R., Mony V. Confocal microscopy // Health Sciences. – 2012. – 1(3): JS004A. – Р. 1 – 6.

Tsien R. Y., Ernst L., Waggoner A. Fluorophores for Confocal Microscopy: Photophysics and Photochemistry In «Handbook of Biological Confocal Microscopy, 3rd Ed.». – New York: Springer, 2006. – Р. 338 – 352.

Zeug A., Woehler A., Neher E., Ponimaskin E. G . Quantitative intensity-based FRET approaches – a comparative snapshot // Biophys. J. – 2012. – Vol. 103 (9). – Р. 1821 – 1827.

* * *

Приведённый ознакомительный фрагмент книги Молекулярная морфология. Методы флуоресцентной и конфокальной лазерной микроскопии (Коллектив авторов, 2014) предоставлен нашим книжным партнёром -

ООО «Мелитэк» поставляет лазерные конфокальные микроскопы. Это современное исследовательское оборудование, которое значительно отличается по своим возможностям от обычных световых микроскопов. С его помощью можно получить не только двухмерные, но и трехмерные изображения, получить информацию о профиле поверхности, измерить толщину полупрозрачных покрытий и пр.

Лазерный конфокальный микроскоп находит свое применение в качестве инструментального микроскопа для измерения линейных размеров, углов, радиусов и пр. Благодаря точности измерения такие микроскопы подходят для контроля качества измерительных, металлообрабатывающих и медицинских инструментов, микроэлектронных компонентов и иных деталей, контроль которых подразумевает проведение измерений в плоскостях XY, XZ и YZ, Одной из особенностей микроскопа LEXT OLS5000 является возможность построения моделей и проведения измерений поверхностий с углом наклона до 87.5 0

Лазерный микроскоп дает возможность изучать структуру и топографию поверхности с возможностью определения перепадов высоты до 6 нм у прозрачных и непрозрачных образцов, что обуславливает его широкое применение в материаловедении, криминалистике и микроэлектронике. Благодаря лазерному источнику света с длиной волны 405 нм подсветке, конфокальной оптической схеме, а так же применении. ФЭУ вместо обычных CMOS или CCD детекторов микросоп LEXT OLS5000 обладает очень малой глубиной резкости, что позволяет определять высоту фокальной плоскости и строить высокоточные 3D модели поверхности. Специальное программное обеспечение позволяет проводить измерение профиля, площади и объема полученных моделей. В плоскости разреза модели можно проводить измерение линейных размеров, радиусов окружностей и углов. Изображения и модели сохраняются в специальном формате, который позволяет провести дополнительные измерения при необходимости.

Характерные особенности, нового конфокального микроскопа LEXT OLS5000:

• определение перепада высот 6 нм
• латеральное разрешение 120 нм
• гарантированная точность измерения линейных размеров на изображениях, полученных методом панорамной сшивки;
• высокая скорость сканирования благодаря специальным алгоритмам;
• повышенная контрастность за счет двойной конфокальной схемы
• цветные изображения с разрешением 4К;
• возможность работать с образцами различных размеров и формы
• инновационные алгоритмы подавления шумов при сканировании.

Специальная модель рамы позволяет проводить измерения образцов высотой до 210 мм, а новые объективы, скорректированные для работы с лазером 405 нм с увеличенной рабочей дистанцией, позволяют исследовать поверхности в углублениях до 25 ммОписания и технические характеристики микроскопов для измерения линейных размеров, представленных в каталоге ООО «Мелитэк», вы найдете на нашем сайте. Если у вас есть вопросы, на них готовы ответить наши сотрудники.

Конфокальная микроскопия — один из методов оптической микроскопии, обладающий значительным контрастом по сравнению с микроскопами классической схемы за счет использования диафрагмы, отсекающей поток фонового рассеяного света. В конфокальном микроскопе в каждый момент времени регистрируется изображение одной точки объекта, а полноценное изображение строится путем сканирования (движения образца или перестройки оптической системы). Для того, чтобы регистрировать свет только от одной точки после объективной линзы располагается диафрагма малого размера таким образом, что свет, испускаемый анализируемой точкой, проходит через диафрагму и будет зарегистрирован, а свет от остальных точек в основном задерживается диафрагмой.

Повышение контраста изображения также достигается за счет того, что осветитель создает не равномерную освещенность поля зрения, а фокусирует свет в анализируемую точку. Это может достигаться расположением второй фокусирующей системы за образцом, но при этом требуется, чтобы образец был прозрачным. Кроме того, объективные линзы обычно сравнительно дорогие, поэтому использование второй фокусирующей системы для подсветки мало предпочтительно. Альтернативой является использование светоделительной пластинки, так чтобы и падающий и отраженный свет фокусировались одним объективом. Такая схема к тому же облегчает юстировку.

Уменьшение отверстия в диафрагме приводит к уменьшению толщины оптического слоя, что повышает контрастность изображения, однако при этом падает его яркость, что требует использования высокочувствительных регистрирующих систем и в процессе исследования заставляет идти на компромисс между яркостью и контрастом получаемого изображения.

Наиболее часто встречающейся задачей для конфокальной микроскопии, благодаря ее высокому разрешению и контрасту, является изучение структуры клеток и их органелл, например, цитоскелета, ЭПР, лизосом, митохондрий, ядра, хромосом и даже генов. Исследуется также колокализация в клетке двух и более веществ. Еще одна задача - исследование динамических процессов, происходящих в живых клетках. Например, клеточного транспорта биологически-активных соединений, изменений концентрации и распределения ионов кальция. Записав в памяти компьютера серию оптических срезов, можно провести объемную реконструкцию объекта и получить его трехмерное изображение, не используя трудоемкую методику изготовления и фотографирования серийных гистологических срезов.

Новыми перспективными направлениями являются методики FRAP - Fluorescence Recovery After Photobleaching (Восстановление флуоресценции после фотовыжигания) и FRET - Fluorescence Resonance Energy Transfer (Передача энергии посредством флуоресцентного резонанса).

Глоссарий:

FRAP применяется для исследования подвижности биоорганических молекул посредством инициации фотохимического разложения флуорохрома в зоне облучения и последующего его рассоединения с молекулами. После выжигания молекулы с флуорохромом из необлученной зоны движутся вследствие диффузии в облученную зону образца. По времени нарастания в ней флуоресценции можно судить о подвижности молекул.

FRET применяется для определения расстояния между молекулами разных типов, их окружения и взаимодействия. Молекулы метятся двумя флуорохромами со спектром испускания донора, перекрывающимся со спектром поглощения акцептора. Энергия от донора к акцептору передается на малых расстояниях (несколько нм) в результате резонанса между энергетическими уровнями, а его вероятность зависит от расстояния между молекулами. Затем акцептор излучает энергию в видимой области спектра, которая регистрируется конфокальным микроскопом.

Двухфотонная (мультифотонная) микроскопия - Two Photon (Multiphoton) Microscopy - Методика, производная от лазерной сканирующей конфокальной микроскопии, при которой возбуждение флуорохромов осуществляется лазерным излучением инфракрасного или длинноволнового видимого диапазона, плотность которого удваивается или даже утраивается в месте фокусировки на образце. Флуорофоры образца переводятся в возбужденное состояние двумя или тремя длинноволновыми фотонами, что эквивалентно возбуждению одним коротковолновым фотоном. Например, возбуждение двумя или тремя фотонами с длиной волны 900 нм эквивалентно возбуждению одним фотоном с длиной волны 450 или 300 нм. Мультифотонная микроскопия обеспечивает более глубокое проникновение в толщу тканей и не требует наличия конфокальной микродиафрагмы, так как ее флуоресценция возникает строго в фокальной плоскости.

Акусто-оптический перестраиваемый фильтр (AOTF) - Acousto- Optic Tunable Filter (AOTF) - Фильтрующее устройство, использующее звуковые колебания для модулирования длины волны или интенсивности света, испускаемого лазером или некогерентным источником света (в первую очередь дуговыми лампами). Фильтр состоит из специализированного кристалла (оксид теллура или кварц), зажатого с двух сторон акустическими излучателем и поглотителем для наведения в кристалле стоячих акустических волн с переменными зонами высокого и низкого преломления. Если поляризованный или неполяризованный свет проходит через фильтр, кристалл воздействует на него как дифракционная решетка, отклоняющая проходящий луч. Для изменения периода дифракционной решетки выбираются характерные длины стоячих волн, получаемые в результате изменения звуковых колебаний, подводимых к кристаллу.

Полосовой фильтр - Bandpass Filter - фильтр, пропускающий определенный диапазон (полосу) длин волн ослабляя при этом волны большей и меньшей длины, чем у пропускаемых. Длина волны в середине пропускаемой полосы обычно называется средней (английская аббревиатура CWL). Эффективная полоса пропускания измеряется шириной зоны, пропускающей половину от максимума падающего света, которая еще называется полосой половинного пропускания (аббревиатуры FWHM и HBW). В флуоресцентной микроскопии полосовые фильтры чаще используются в тракте возбуждения и реже в качестве пороговых (барьерных) фильтров.

Светоделитель - Beamsplitter - Оптическое устройство, используемое для разделения падающего светового луча на две или более составляющих, каждые из которых проецируются в различных направлениях. Для выполнения каких-либо определенных условий светоделители бывают различных конфигураций. В окулярных блоках оптических микроскопов используются призматические светоделители для одновременного проецирования изображения в окуляры и фотокамеру (цифровую камеру). Для получения линейно поляризованного света применяются поляризующие светоделители из природного кварца - материала с двойным преломлением. В флуоресцентной микроскопии для отражение волн возбуждения обратно к источнику и пропускания более длинноволнового вторичного флуоресцентного излучения к окулярам и детектору в качестве светоделителей используются дихроматичные (дихроичные) зеркала.

Холодное зеркало - Cold Mirror - Специализированный дихроматичный интерференционный фильтр, который в очень широком диапазоне температур отражает весь видимый спектр, но очень эффективно пропускает волны в инфракрасной области. Аналогично горячим зеркалам холодные могут быть разработаны для отражения лучей, падающих под углами от нуля до 45 градусов и представлять собой многослойные диэлектрические покрытия наподобие интерференционных фильтров. Холодные зеркала могут использоваться в качестве дихроматических светоделителей в лазерных системах для отражения видимого света и пропускания инфракрасного.

Дихроматичный светоделитель (дихроичное зеркало) - Dichromatic Beamsplitter (Dichroic Mirror) - Комбинация интерференционных фильтров/зеркал обычно применяемая в наборах фильтров для флуоресцентной микроскопии для получения четко определяемого перехода между пропускаемыми и отраженными длинами волн. Дихроматичное зеркало, наклоненное под углом 45 градусов к падающему свету и испускаемому излучению, отражает коротковолновое излучение возбуждения под углом 90 градусов на образец и пропускает более длинноволновое излучение от образца на окуляры и детектор. Дихроматичные зеркала для флуоресцентной микроскопии, изготовленные с использованием тонких интерференционных пленок способны отразить до 90 % возбуждающего излучения, одновременно пропуская до 90 % полосы флуоресцентного излучения. Дихроматичные зеркала обычно являются центральным (основным) элементом в трех видах фильтров (возбуждения, барьерных и дихроматичных зеркал), находящихся в составе блока флуоресцентных оптических фильтров.

Скат фильтра - Filter Slope - Скат оптического фильтра - это характеристика профиля фильтра в области перехода от запирания к пропусканию. В целом, скат фильтра характеризуется длиной волны, на которой фильтр демонстрирует определенный коэффициент пропускания и крутизну характеристики в этом месте. Два различных фильтра могут иметь одни и те же частоты среза, но совершенно разные уровни запирания и скаты. Фильтры с очень крутыми скатами имеют узкую полосу пропускания, в то время как пологие скаты означают широкую полосу.

Полная ширина на половине максимума - Full Width at Half Maximum (FWHM) - Диапазон длин волн пропускаемых стеклянным или интерференционным фильтром описывается параметром, известным как полная ширина на половине максимума (FWHM). Границы среза определяются как наименьшая и наибольшая длины волн, пропускаемые фильтром на уровне 50% от максимума, а средняя длина волны (CWL или СДВ) представляет собой среднее арифметическое от всех длин волн внутри диапазона. Например, величина FWHM, равная 40 означает, что ширина пропускаемого диапазона волн составляет 40 нм, причем значение СДВ (CWL) может лежать где угодно от ультрафиолетовой до инфракрасной частей спектра. Во многих текстах FWHM может обозначаться как половинная полоса пропускания (half bandwidth, HBW).

Видеокамеры ISIT - Intensifier Silicon- Intensifier Target (ISIT) Camera - Видеокамеры, предназначенные для работы при низком уровне освещения, как например в флуоресцентной микроскопии образцов с очень низким квантовым выходом. Эти камеры как правило включают в себя SIT - трубку (с диодной матрицей) дополненную усилителем изображения в комбинации с волоконной оптикой на первой ступени усиления света.

Ближнепольная сканирующая оптическая микроскопия (БСОМ ) - Near- Field Scanning Optical Microscopy (NSOM) - Ближнепольное изображение получается при размещении оптического зонда (световода) субмикронного размера на чрезвычайно близком расстоянии от изучаемого объекта, а свет пропускается через небольшую диафрагму на конце зонда. Под ближним полем понимается зона над поверхностью изучаемого объекта размером меньше длины волны падающего света. В пределах ближнего поля затухающий свет не ограничен дифракцией, и возможно получение информации относительно объектов нанометрового порядка. Это явление позволяет получать изображения за пределами дифракционного барьера и проводить спектроскопию образцов, недостижимую средствами обычной оптической микроскопии.